Johnny Test jest, jak jego rówieśnicy, zwykłym 11-latkiem, mającym wiernego przyjaciela, mówiącego psa Dukey'a. Johnny ma też, na jego nieszczęście, dwie siostry bliźniaczki - Mary i Susan. Są one wynalazczyniami mającymi własne tajne laboratorium i często Johnny wbrew swej woli, jest ich królikiem doświadczalnym. Testy kończą się różnie, co często doprowadza do niezwykłych zdarzeń i wypadków.